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如何提升CY5/CY5.5熒光成像效果之濾光片篇

一、cy5/5.5光譜特征圖

花氰染料cy5/cy5.5常用于生物分子標(biāo)記，在熒光顯微成像、流式細(xì)胞儀分析、小動(dòng)物活體標(biāo)記成像中均有廣泛使用。Cy5最大激發(fā)波長(zhǎng)一般在649nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)一般在670nm；cy5.5最大激發(fā)波長(zhǎng)一般在673nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)一般在695nm。其激發(fā)特征在近紅外（紅外）譜段，且激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)半高寬（特征譜線中峰值一半對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)寬度）較窄，對(duì)濾光片組的選擇要求較高，否則熒光信號(hào)較弱或無(wú)法捕獲熒光信號(hào)。

左cy5光譜特征圖，右cy5.5光譜特征圖

二、Cy5/cy5.5熒光成像中的濾光片選擇

熒光成像基于斯托克斯位移原理，其基本表現(xiàn)為熒光物質(zhì)經(jīng)過(guò)特定波長(zhǎng)的光激發(fā)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。其激發(fā)和發(fā)射過(guò)程對(duì)應(yīng)到熒光顯微成像系統(tǒng)中的兩個(gè)關(guān)鍵部件分別是熒光光源和熒光激發(fā)塊，Cy5/cy5.5的熒光成像原理也是如此，只是其激發(fā)和發(fā)射特征偏向于近紅外（紅外），對(duì)于濾光片的選擇需更加注意。

Stokes位移，能級(jí)躍遷產(chǎn)生熒光信號(hào)

發(fā)射光譜比激發(fā)光譜波長(zhǎng)更長(zhǎng)

cy5/cy5.5熒光成像的核心部件：熒光激發(fā)塊。由三片濾光片組成：激發(fā)濾光片、二向分光鏡、發(fā)射濾光片。激發(fā)濾光片允許特定波長(zhǎng)的光通過(guò)；二向分光鏡反射短波長(zhǎng)的光，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光；發(fā)射濾光片，只透過(guò)所要觀察波長(zhǎng)的光，把不需要的波長(zhǎng)的光去除。

激發(fā)塊示意圖，由三組濾光片組成

熒光濾光片主要有三種，LP長(zhǎng)通濾光片，限定波長(zhǎng)長(zhǎng)于指定值的光可以通過(guò)；SP短通濾光片，限定波長(zhǎng)短于指定值的光可以通過(guò)；BP帶通濾光片，可以讓中心波長(zhǎng)附近一定波長(zhǎng)的光通過(guò)，當(dāng)這個(gè)范圍比較窄的時(shí)候，我們還會(huì)給這種帶通濾光片“窄帶濾光片”的稱呼。

濾光片的三種類型：長(zhǎng)通（LP）、短通（SP）、帶通（BP）

使用帶通濾光片可以獲得相對(duì)更高信噪比的熒光成像，而不同參數(shù)的帶通濾光片，會(huì)對(duì)成像效果有重大影響，比如下圖A和B兩組帶通濾光片，A組濾光片是窄帶，搭配比B組能多檢測(cè)出90%的有用信號(hào)，減少200%的背景干擾信號(hào)，在圖像上表現(xiàn)為A組信號(hào)更清晰透亮。此外，由于技術(shù)水平問(wèn)題，國(guó)內(nèi)窄帶濾光片的截止深度（OD）要比進(jìn)口差，光譜表現(xiàn)為光通效率到邊緣“緩坡下降”而不是“斷崖下降”，最終成像效果不如進(jìn)口窄帶，單要稍優(yōu)于普通帶通。

窄帶濾光片成像更高信噪比

熒光信號(hào)的獲取在于激發(fā)光和發(fā)射光的選擇，激發(fā)濾光片需匹配光源中心波段與染料激發(fā)譜段，發(fā)射濾光片需覆蓋染料發(fā)射譜段峰值。以下是cy5、cy5.5兩個(gè)典型chroma公司濾光片組光譜圖。

Chroma CY5濾光片組EX:620/60，DM:660，EM:700/75

Chroma CY5.5濾光片組EX:650/45，DM:685，EM:720/60

三、明美濾光片選擇

濾光片的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用、成本來(lái)綜合考量，進(jìn)口大截止深度、小窄帶寬度的濾光片有更好的效果，但成本也是顯著更高的，某些僅能適用cy5/cy5.5幾種染料，某些適用范圍更廣，所對(duì)應(yīng)的效果和成本也會(huì)有所變化，同時(shí)有的還考慮到與現(xiàn)有的光源、顯微鏡適配，選擇也會(huì)存在差異化。針對(duì)cy5/cy5.5等熒光染料，明美可提供國(guó)內(nèi)和國(guó)外不同廠家不同品質(zhì)型號(hào)的濾光片組，適用于奧林巴斯BX2或BX3系列、尼康Te/Ti系列、尼康50i/80i/90i、徠卡DM2500/3000/4000/5000/6000、蔡司Axio Imager等四大品牌多種信號(hào)，保證您的實(shí)驗(yàn)效果，歡迎來(lái)電咨詢！

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