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在之前的系列文章中，我們已經(jīng)給大家介紹過如何從攝像頭、熒光光源、熒光激發(fā)塊幾方面提升CY5/CY5.5的成像效果，今天我們繼續(xù)為大家?guī)?，如何從物鏡層面進(jìn)行提升。

一、物鏡如何影響CY5/CY5.5熒光成像？

落射熒光顯微成像中，選擇一個(gè)合適的物鏡對(duì)于良好的熒光顯微成像質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用。因?yàn)槁渖錈晒獬上裰屑ぐl(fā)光和發(fā)射光均要經(jīng)過物鏡，物鏡的熒光通過率會(huì)非常影響成像熒光效率，熒光通過率低的物鏡成像信號(hào)會(huì)更弱，信噪比低。cy5/cy5.5標(biāo)記的熒光成像信號(hào)比一般的弱，因此需要更好的物鏡，一般建議至少需要半復(fù)消色差級(jí)別的物鏡，這個(gè)級(jí)別或以上的物鏡，才能有效透過熒光信號(hào)，提供高對(duì)比度、無背景熒光噪聲的圖像。

落射熒光成像中光要經(jīng)過物鏡兩次

二、如何選擇合適的熒光物鏡

在落射熒光成像中，物鏡既是落射熒光系統(tǒng)的“聚光鏡”，也是利用光線使標(biāo)本第一次成實(shí)像的核心部件，因而直接關(guān)系和影響成像的質(zhì)量和各項(xiàng)光學(xué)技術(shù)參數(shù)。在cy5/cy5.5熒光顯微成像應(yīng)用中，想要獲得理想的成像效果，需重點(diǎn)對(duì)物鏡以下幾個(gè)參數(shù)進(jìn)行考量。

顯微鏡物鏡標(biāo)識(shí)

（1）數(shù)值孔徑。在物鏡參數(shù)中可用NA表示，一般在倍數(shù)標(biāo)識(shí)后面，在空氣系物鏡中，NA值小于1，油鏡或水鏡可大于1，NA值越大，代表該物鏡分辨率越高，細(xì)節(jié)表現(xiàn)越清晰。簡(jiǎn)單理解，同樣倍數(shù)的物鏡，數(shù)值孔徑越高，收集光的能力越強(qiáng)，細(xì)節(jié)越好。

分辨率越高細(xì)節(jié)越清楚

（2）色差矯正能力和場(chǎng)曲。數(shù)值孔徑越高，樣品細(xì)節(jié)越清晰，但同時(shí)高倍放大下的色差也會(huì)更明顯。色差是不同波長(zhǎng)的光在同一介質(zhì)中有不同的折射率，在物鏡成像時(shí)導(dǎo)致的光學(xué)瑕疵，通俗的理解就是圖像有光暈。通過不同透鏡組合設(shè)計(jì)，可減少或消除色差，根據(jù)對(duì)波長(zhǎng)矯正覆蓋范圍大小，可分為消色差（ACH）、半復(fù)消色差（FL/Semi-APO）、復(fù)消色差（APO）物鏡，同樣倍數(shù)物鏡，消色差越強(qiáng)數(shù)值孔徑也越高；不同品牌的同級(jí)消色差設(shè)計(jì)，光譜矯正覆蓋范圍會(huì)有不同，大致可參考下圖。

cy5/cy5.5的最大發(fā)射波長(zhǎng)一般都在670nm以上，甚至可達(dá)700nm，因此低數(shù)值孔徑的消色差物鏡不太好用，使用數(shù)值孔徑更高的半復(fù)消色差物鏡和復(fù)消色差物鏡效果更好，信號(hào)更強(qiáng)，信噪比高，可減少信號(hào)附近的色差。

左有色差矯正，右無矯正

另外還有一點(diǎn)是場(chǎng)曲矯正，會(huì)影響視場(chǎng)清晰的范圍，有場(chǎng)曲矯正能力的物鏡一般稱為平場(chǎng)物鏡（plan），可矯正透鏡成像導(dǎo)致的圖像畸變，使整個(gè)視野都平坦清晰。

無場(chǎng)曲矯正，圖像存在畸變

明美物鏡方案

（1）M-UPlanFLN系列

?平場(chǎng)半復(fù)消色差物鏡

?高數(shù)值孔徑，分辨率高

?高透光率

（2）PlanFluor系列

?平場(chǎng)半復(fù)消色差物鏡

?高數(shù)值孔徑，提供高清晰度、高對(duì)比度熒光圖像

?熒光成像背景信號(hào)更純凈

（3）Apo系列

?平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，可對(duì)700nm附近的圖像色差進(jìn)行矯正

?高數(shù)值孔徑，分辨率高

?弱熒光信號(hào)下成像清晰

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