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光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤點：DIC

DIC是微分干涉Differential Interference Contrast的縮寫，這種顯微鏡由Francis Smith于1947年左右發(fā)明，然后由Georges Nomarski在1952年改良并沿用至今。它可以用于細胞等透明樣品成像，并且成像具有強三維立體感。在透明樣品成像中，與相襯（phase contrast）和斜照明（oblique contrast）技術(shù)相比，DIC可以適用于略厚一點的樣品，且有更強的立體感、更高的數(shù)值孔徑，細節(jié)表現(xiàn)更豐富。

DIC觀察下的細胞，MF43-N目鏡拍攝

一、成像原理

1、生物應(yīng)用的微分干涉（透射）

透射式微分干涉光路圖

DIC成像可以分為三段過程理解：產(chǎn)生方向垂直的兩束偏振光，兩束光通過樣品形成相位差變化，最后將相位差轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別。首先產(chǎn)生方向垂直的兩束偏振光，光源通過起偏器產(chǎn)生特定振動方向的偏振光，經(jīng)過DIC棱鏡將偏振光變?yōu)閮墒穹恢碌较虼怪钡钠窆狻墒窆庵g存在極小的裂隙（即兩束光照在樣本上的位置相距很近，小于顯微鏡的分辨率，因此不會產(chǎn)生重影現(xiàn)象）與相位差。

這兩束偏振光經(jīng)過樣本后，由于樣本中存在不同厚度和折射率，加大兩束偏振光的相位差。

最后相位差改變的兩束偏振光被上DIC棱鏡重新匯合，再通過檢偏鏡形成建設(shè)性干涉（變亮）和破壞性干涉（變暗），樣品的細節(jié)得以呈現(xiàn)，同時在光束裂隙的方向上呈現(xiàn)出三維立體的浮雕效果。

DIC常用于藻類等微型生物研究，引自論文①

2、金相應(yīng)用的微分干涉（落射）

反射式微分干涉光路圖

落射微分干涉與透射微分干涉成像原理相同，結(jié)構(gòu)不同，落射微分干涉只需要一個DIC棱鏡，主要用于金相領(lǐng)域、晶圓檢查等。

落射照明器中包含起偏器、檢偏器和DIC棱鏡，光經(jīng)過起偏器和DIC棱鏡，形成方向垂直的兩束偏振光，樣品表面折射率差異和高度差異會引起相位變化，增強相位差異，然后兩束光反射后第二次進入DIC棱鏡，被合并，再經(jīng)過檢偏器形成明暗差和浮雕立體感。

導(dǎo)電粒子圖像，明美MJ43拍攝

二、關(guān)鍵部件

最初的DIC顯微鏡是由偏光顯微鏡改造而成的，因此偏光顯微鏡的一些核心配件也是DIC顯微鏡的核心配件，包括起偏器、檢偏器、無應(yīng)力物鏡，以及DIC核心配件，帶滑動器DIC棱鏡。特殊配置可能還有de sénarmont補償器等配件，基本思路類似偏光顯微鏡的補償器，可以調(diào)整增強透明樣品效果，這里不作討論。

DIC關(guān)鍵部件一覽

1、起偏器：將自然光轉(zhuǎn)化成偏振光，放置在光源和聚光鏡之間。

2、檢偏器：轉(zhuǎn)化有相位差的偏振光為有明暗差異的成像，放置在DIC棱鏡與管鏡之前，在物鏡之后，通常在物鏡轉(zhuǎn)盤。檢偏器跟起偏器組成正交偏光配置。

3、DIC棱鏡：由兩片沿對角線切開的石英楔子膠結(jié)組成的分光器，用于將一束偏振光分解為兩束垂直的偏振光，或者反過來將兩束偏振光合成一組偏振光。DIC棱鏡有滑行器，用于旋轉(zhuǎn)鏡片調(diào)整方向。透射配置需要一對DIC棱鏡，反射配置只需要一個。

4、DIC物鏡：DIC物鏡上面會有DIC字樣，規(guī)格最低要求是無應(yīng)力物鏡，消色差可以是平場消色差或以上。部分新工藝新材料制造的APO復(fù)消色差物鏡也是無應(yīng)力物鏡，雖然沒有DIC字樣，也可以作為DIC物鏡使用。

在一些DIC顯微鏡中，DIC物鏡要與物鏡棱鏡搭配使用，不同倍數(shù)搭配不同的棱鏡，這些物鏡棱鏡是小型化的DIC棱鏡。這些顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)盤每個孔位都有一個插槽用于安裝物鏡棱鏡，而這些DIC物鏡上除了“DIC”字樣，還有特殊的數(shù)字或英文標(biāo)記，比如“N2”“M”之類，用于指示搭配的物鏡棱鏡。

另外需要提到的一點是，DIC顯微鏡對光源強度有一定要求，在40X以內(nèi)物鏡成像時，50W鹵素?zé)艋蛘?W的LED應(yīng)該夠用，100X物鏡等高倍觀察，需要100W或以上的鹵素?zé)艋蛘吒吖鈴姷腖ED燈。

三、成像特點

DIC拍攝的硅藻：強立體，豐富細節(jié)，色彩純粹

1、強立體感。DIC成像最大特點是強立體感，在透明細胞成像中，細胞核、線粒體等大細胞器會有很強的立體感，因此特別適合顯微操作，比如基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等。

2、豐富細節(jié)。DIC成像中聚光鏡光闌是全開的，因此可以獲得更高的數(shù)值孔徑，得到的細節(jié)比相襯、斜照明更好。

3、無光學(xué)瑕疵。相襯觀察會有光暈偽影，斜照明可以找到照明不均勻?qū)е碌恼麄€畫面明暗漸變，還有較大色散，而調(diào)試良好的DIC成像沒有光學(xué)瑕疵，在透明樣品成像中通常會得到純凈、灰白的背景。

需要提醒的是，DIC并不適合塑料培養(yǎng)皿，塑料培養(yǎng)皿會破壞偏振光的方向性，從而降低最終成像的對比度。

四、主要應(yīng)用

①生物學(xué)領(lǐng)域

DIC搭配熒光成像是很多論文常用配圖②

DIC是透明樣品成像效果更好的方法，因此在細胞、酵母、線蟲、微小生物等透明樣品研究中，常作為相襯觀察的高級替代方案，通常搭配熒光成像用在論文配圖中。

②電子質(zhì)檢和材料學(xué)領(lǐng)域

在液晶面板質(zhì)檢等電子質(zhì)檢領(lǐng)域中，很多材料細節(jié)和處理瑕疵都是常規(guī)照明方式下難以觀察的，而DIC就是非常適合這種需求的觀察方式。

MJ33-DIC拍攝的導(dǎo)電粒子

比如在液晶面板ACF層結(jié)構(gòu)中有導(dǎo)電粒子，其填充情況對面板良率有極大影響，使用DIC照明可以看到導(dǎo)電粒子形成的微小凸起，從而快速評估工藝結(jié)果是否符合預(yù)期。此外液晶屏噴漆的漆體顆粒、液晶屏細微劃痕等瑕疵，也可以使用DIC觀察發(fā)現(xiàn)。

MJ43明場拍攝的芯片

此外，在PCB質(zhì)檢中也存在類似情況，焊盤的劃痕和缺陷、基板的缺陷和異常都可以在DIC觀察中清晰發(fā)現(xiàn)，而在常規(guī)環(huán)形燈照明和落設(shè)照明中都無法發(fā)現(xiàn)這些細節(jié)。

五、明美產(chǎn)品推薦

①生命科學(xué)推薦產(chǎn)品：ML51-DIC

簡單易用的透射DIC觀察，成像質(zhì)量高

10X/23mm大視野目鏡，更高工作效率

研究級機身，可選擇熒光觀察等豐富擴展

適用于水生生物、細胞爬片等透明樣品觀察

②推薦產(chǎn)品：MJ43-DIC/MJ33-DIC

僅需添加DIC棱鏡即可進行DIC觀察

支持透射金相、落射金相、落射DIC和偏光觀察

研究級機身，可擴展暗場、熒光等觀察方式

適用于導(dǎo)電粒子、電路板瑕疵缺陷等材料表面觀察

①Definition of a High-Resolution Molecular Marker for Tracking the Genetic Diversity of the Harmful Algal Species Eucampia zodiacus Through Comparative Analysis of Mitochondrial Genomes, Front. Microbiol., 24 March 2021, Sec. Aquatic Microbiology, Volume 12 - 2021 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.631144

②Kiersten A HendersonAdam L HughesDaniel E Gottschling (2014) Mother-daughter asymmetry of pH underlies aging and rejuvenation in yeast eLife 3:e03504.,  https://doi.org/10.7554/eLife.03504

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